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Dec 16, 2023

Partículas magnéticas de hidrogel melhoram o sequenciamento de nanoporos da SARS

Relatórios Científicos volume 13,

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 2163 (2023) Cite este artigo

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Apresentamos aqui um fluxo de trabalho ativado por partículas de hidrogel magnético para capturar e concentrar SARS-CoV-2 de amostras de swab remanescentes de diagnóstico que melhora significativamente os resultados de sequenciamento usando a plataforma de sequenciamento Oxford Nanopore Technologies MinION. Nossa abordagem utiliza uma nova partícula de hidrogel magnético baseada em afinidade, contornando os volumes de amostra de entrada baixa e permitindo fluxos de trabalho rápidos manuais e automatizados de alto rendimento que são compatíveis com o sequenciamento Nanopore. Essa abordagem aprimora os protocolos de extração de RNA padrão, fornecendo melhorias de até 40 × nas leituras de mapeamento viral e melhora a cobertura de sequenciamento em 20 a 80% de amostras remanescentes de diagnóstico de título mais baixo. Além disso, demonstramos que esta abordagem funciona para vírus influenza artificial e amostras de vírus sincicial respiratório, sugerindo que pode ser usado para identificar e melhorar os resultados de sequenciamento de vários vírus em amostras VTM. Esses métodos podem ser executados manualmente ou em uma plataforma de automação KingFisher.

Em 10 de abril de 2022, houve mais de 500 milhões de casos de COVID-19 e quase 6,2 milhões de mortes relacionadas ao COVID-19 em todo o mundo1. As mutações virais permitiram que a pandemia permeasse a vida cotidiana, apesar do uso de medidas de saúde globais generalizadas para impedir a propagação do SARS-CoV-2. A detecção e o monitoramento de variantes virais emergentes tornaram-se ferramentas críticas na resposta global à saúde, destacando a necessidade de métodos de sequenciamento precisos e rapidamente implementáveis2,3,4,5. Avanços recentes nas tecnologias de sequenciamento de próxima geração (NGS) tornaram mais possível o uso rotineiro de sequenciamento para monitoramento e identificação de surtos virais, mas muitos instrumentos NGS não são portáteis e ainda têm custo proibitivo, limitando assim sua adoção geral6,7. A plataforma Oxford Nanopore Technologies (ONT) MinION oferece uma estratégia de detecção relativamente barata e portátil, capaz de identificar e sequenciar vários vírus respiratórios no campo8,9,10.

Embora os avanços no sequenciamento tornem possível a detecção e caracterização rápidas no local do SARS-CoV-2 e de outros genomas virais, esses sequenciadores portáteis ainda são limitados por certas desvantagens, a saber, a menos que grandes quantidades de RNA viral sejam usadas para as reações de sequenciamento, há pode haver problemas de precisão durante a chamada de base11,12,13,14,15,16. Essas limitações técnicas reduzem a utilidade de uma ferramenta que poderia melhorar a capacidade de responder com rapidez e precisão a surtos virais e rastrear a transmissão em tempo real.

Aumentar a quantidade total de material de RNA para análise por meio do enriquecimento da amostra é uma estratégia disponível para melhorar o desempenho das plataformas de sequenciamento. Para esse fim, procuramos abordar as limitações de sequenciamento viral de um sequenciador de nanoporos aplicando a tecnologia de enriquecimento de partícula de hidrogel magnético baseada em afinidade (partícula Nanotrap) a amostras de meio de transporte viral (VTM) de SARS-CoV-2. Resumidamente, as partículas magnéticas de hidrogel melhoram o desempenho do ensaio, facilitando a ligação rápida do analito (por exemplo, vírions intactos) a partir de grandes volumes de amostra e reduzindo a presença de substâncias interferentes nos ensaios a jusante. As partículas de hidrogel capturam e concentram analitos de interesse usando pequenas moléculas, como corantes de afinidade, que são imobilizadas em uma estrutura de cadeias poliméricas reticuladas. Estas pequenas moléculas ligam-se aos seus alvos (por exemplo, proteínas da superfície do virião), frequentemente com uma afinidade muito elevada, através de uma combinação de interacções electrostáticas e hidróficas. Uma vez ligados à partícula de hidrogel magnético, os virions podem ser concentrados e removidos da matriz da amostra usando uma simples etapa de separação magnética. Após a concentração, os vírions são fortemente ligados ao corante de afinidade da partícula de hidrogel e os ácidos nucléicos virais não estão disponíveis para análise molecular. Como tal, um kit de extração de ácido nucleico é usado para lisar os vírions e purificar os ácidos nucleicos virais em preparação para um ensaio molecular a jusante. A tecnologia de partículas Nanotrap mostrou ampla aplicação em diagnósticos clínicos, enriquecendo e estabilizando biomarcadores e analitos em amostras clínicas complexas. Estudos recentes demonstraram esse processo de concentração e extração, mostrando que as partículas de hidrogel magnético são capazes de concentrar e melhorar a detecção de muitos tipos virais, incluindo SARS-CoV-2, em múltiplos ensaios moleculares17,18,19,20,21.