blog

Dec 08, 2023

Análises de perturbação multimodal de ciclina

Relatórios Científicos volume 13,

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 7678 (2023) Citar este artigo

851 Acessos

1 Altmétrica

Detalhes das métricas

O controle do ciclo celular é realizado por quinases dependentes de ciclina (CDKs), motivando uma extensa pesquisa em CDK visando drogas de moléculas pequenas como terapêutica contra o câncer. Aqui usamos perturbações CRISPR/Cas9 combinatórias para descobrir uma extensa rede de interdependências funcionais entre CDKs e fatores relacionados, identificando 43 interações letais sintéticas e 12 interações sinérgicas. Dissecamos as perturbações de CDK usando RNAseq de célula única, para o qual desenvolvemos uma nova estrutura computacional para quantificar com precisão os efeitos do ciclo celular e diversos estados celulares orquestrados por CDKs específicos. Embora a interrupção pareada de CDK4/6 seja sintética letal, apenas a CDK6 é necessária para a progressão normal do ciclo celular e ativação transcricional. Múltiplas CDKs (CDK1/7/9/12) são sintéticas letais em combinação com PRMT5, independente do controle do ciclo celular. A análise aprofundada da expressão do mRNA e dos padrões de splicing fornece várias linhas de evidência de que a dependência de CDK-PRMT5 é devida à regulação transcricional aberrante, resultando em término prematuro. Essas interdependências se traduzem em sinergias entre drogas, com implicações terapêuticas no câncer e em outras doenças.

A regulação e a transição entre as fases do ciclo celular são realizadas principalmente por quinases dependentes de ciclina (CDKs) e proteínas ciclinas associadas1. A família CDK é grande, com mais de 20 genes codificadores de proteínas distintos, e há uma incerteza substancial em relação às funções específicas de membros individuais da família1,2. Canonicamente, as proteínas CDK foram divididas em duas classes funcionais: fatores que regulam o ciclo celular, como CDK1, 2, 4 e 6, e fatores que participam do controle geral da transcrição, como CDK7, 9 e 121 (Fig. 1a, Suplemento Estendido Fig. 1). As CDKs transcricionais desempenham um papel crítico na regulação da RNA polimerase II (RNAPII), com diversas funções na iniciação, alongamento e terminação. CDK7,9 e 12 demonstraram fosforilar RNAPII diretamente. No entanto, ainda há muita incerteza quanto ao papel mecanicista e importância funcional de cada CDK transcricional. Por exemplo, CDK8 (funcionando como parte do complexo Mediador) foi relatado como um repressor e ativador da transcrição, e CDK7 estabeleceu papéis na iniciação, capping, pausa promotor-proximal e fosforilação de CDK93,4. A CDK9 é essencial para o alongamento transcricional, com o knockdown de CDK12 também levando ao comprometimento global da transcrição, especialmente entre genes longos, e genes de resposta a danos no DNA1,5,6. No entanto, muitas CDKs demonstraram funcionar tanto no ciclo celular quanto nas funções de transcrição, bem como em diversas outras vias7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Por exemplo, as proteínas do ciclo celular e da classe transcricional podem ativar os reguladores epigenéticos EZH2, AR, PRMT5 e PARP111,17,18,19,20 ou interagir com a sinalização celular proliferativa através da via do fator de crescimento transformador beta (TGFβ)21,22 . A imagem emergente é que as CDKs governam uma rede complexa de funções sobrepostas e sinérgicas, com rótulos de "ciclo celular" e "transcricional" fornecendo diretrizes úteis, mas incompletas.

Mapeamento sistemático da função do gene CDK em células de câncer de mama triplo negativo. (a) As proteínas CDK controlam a progressão do ciclo celular e atuam como reguladores da transcrição, ganhando interesse como potenciais alvos de drogas (cores). (b) Esquema que descreve a abordagem combinatória de triagem de aptidão CRISPR/Cas9 para mapear interações sinérgicas e sintéticas letais de CDK. Uma biblioteca de construtos duplos de sgRNA direcionados a pares de genes listados em (a) foi sintetizada como um pool de oligonucleotídeos e clonada em um vetor de superexpressão lentiviral (topo). Linhagens de células TNBC foram transduzidas com vírus que codificam para esta biblioteca e submetidas a triagem competitiva de crescimento. Os valores de aptidão de construção de sgRNA duplos resultantes foram usados ​​para extrair valores de aptidão de gene único e mapear interações genéticas. (c) Esquema que descreve a abordagem de fenotipagem transcricional de célula única para mapear o impacto funcional das perturbações genéticas de CDK. Uma biblioteca de sgRNA direcionada aos genes em (a) foi clonada em um vetor de superexpressão lentiviral compatível com scRNA-seq e usada para transduzir linhas celulares TNBC em formato agrupado. Uma semana após a transdução, o scRNA-seq foi realizado usando a plataforma 10x Chromium.